本文目录一览：
- 1、如何确定PCR反应中的退火温度和延长时间?
- 2、pcr过程中退火温度是什么决定的
- 3、pcr退火温度怎么确定?
- 4、实时荧光定量PCR——RT-QPCR
- 5、引物tm值低于50,怎么设置pcr退火温度
- 6、PCR的退火温度怎么选择
如何确定PCR反应中的退火温度和延长时间?
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
先95度，dna在高温下变性，解链成单链分子 然后退火，具体温度与所用引物有关，就以55度为例吧。引物与单链dna模板结合上去 再72度延伸，在taq聚合酶的作用下，引物延伸。该循环结束。
延伸时间你看下酶的说明书，自己算，稍微长一点没关系。至于退火温度，你可以做个梯度。
按照你使用的DNA聚合酶来确定退火时间，taq系列的一般30秒够了，pfu系列的15秒，primerstar的一般5秒就够了，建议先确定你用什么酶，然后参照下使用说明书，如果不放心的话退火时间比使用说明书上多5秒足够了。-qpcr退火温度怎么确定
公式中，Tm表示退火时间，Size = 引物长度。退火，主要是指将材料曝露于高温一段很长时间后，然后再慢慢冷却的热处理制程。主要目的是：(1)释放应力，(2)增加材料延展性和韧性，(3)产生特殊显微结构。-qpcr退火温度怎么确定
pcr过程中退火温度是什么决定的
退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。引物与模板复性所需要的退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物长度越短，引物中G+C的含量越低，所需的退火温度越低。
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。-qpcr退火温度怎么确定
通常来说，退火温度是由引物的GC%含量决定的，但是反应体系的条件改变也会影响引物的退火温度（如Mg，Na等离子浓度）。
pcr退火温度怎么确定?
同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。-qpcr退火温度怎么确定
退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。-qpcr退火温度怎么确定
58C，如果是有模板的话，58C或再低一些都可以，其实退火温度不需要刻意去要求，一般的PCR，52-60C就可以全解决。
通常引物与模板的退火温度在45-55度。优化退火温度最好的方法是设置一系列对照反应，即通过在低于计算出的引物Tm值2-10度的温度范围内，进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。
一般的退火温度为55℃至60℃，有的资料至70度。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃，Tm值确定了，退火温度一般也是确定的啦，Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 。
在pcr反应过程中，要使用三个不同的温度变化，有变性，退火，扩增三个不同的反应阶段，而这三个反应需要的最适温度不同。
实时荧光定量PCR——RT-QPCR
1、实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR， 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。-qpcr退火温度怎么确定
2、rt-qpcr全称为实时荧光定量（Real Time Quantitative）RT-qPCR属于第二代PCR技术，与常规的PCR技术相比，RT-qPCR技术可对DNA起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。-qpcr退火温度怎么确定
3、在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。
4、rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同，具体如下：RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。-qpcr退火温度怎么确定
引物tm值低于50,怎么设置pcr退火温度
1、可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。-qpcr退火温度怎么确定
2、退火温度比引物Tm低5度只是建议温度，如果Tm不一致，最好按照高的那个，可以减少非特异性产物。或者可以试试不同的退火温度。
3、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。-qpcr退火温度怎么确定
4、变性反应温度的设置 当温度控制在90 °C以上时DNA会发生变性，双链DNA解链成单链。退火反应温度的设置 当温度下降到50 °C的时候，DNA复性，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。-qpcr退火温度怎么确定
5、不同的PCR MIX所设置的退火温度是不一样的，有的比最低Tm值低5℃，有的低3℃，请你参考你所买的PCR MIX的说明书，上面肯定有详细说明。一般PCR比最低Tm值低1-5℃，都没什么问题。
PCR的退火温度怎么选择
同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。-qpcr退火温度怎么确定
58C，如果是有模板的话，58C或再低一些都可以，其实退火温度不需要刻意去要求，一般的PCR，52-60C就可以全解决。
在设置退火温度：低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
